连续制造对蛋白质药物来说仍是新概念，今年7月份ICH发布的Q13《原料药与制剂的连续制造》指南中专门有一个附件来介绍治疗性蛋白原液的连续制造。美国FDA最近在介绍其监管科学行动的“影响力故事”专栏中介绍了药品审评与研究中心（CDER）研究人员与外部利益相关者合作研究治疗性蛋白质药物连续制造中如何控制病毒安全性的影响。
转变治疗性蛋白质药物制造范式治疗性蛋白质的制造通常包括在工程细胞系中表达目标蛋白质，然后是一系列纯化步骤以去除与产品和工艺相关的杂质。对于在哺乳动物细胞系中表达的治疗性蛋白质，宿主细胞可能含有多个拷贝的内源性逆转录病毒样序列，除了靶蛋白外，还可以产生逆转录病毒样颗粒(RVLP)。尽管RVLP通常被认为是有缺陷的，但一些已被证明会感染非啮齿动物细胞系。也可能发生来自原材料或人员的外源性病毒污染。因此，ICHQ5A指南采取三管齐下的方法来解决病毒安全风险：i)起始物料测试（即细胞库测试），ii)原材料和中间体测试，以及iii)纯化过程中的病毒清除测试。纯化过程包括非专用（即，色谱法）和专用病毒清除步骤（即，化学灭活和病毒过滤），以有效清除成品制剂中的RVLP（和任何可能的病毒污染物）。在过去的二十年里，CDER领导了一项合作研究计划，以更好地了解如何在使用色谱、化学灭活和过滤步骤的蛋白质生物制剂制造过程中去除病毒颗粒。这项研究支持了监管政策和推荐做法、标准和全行业技术报告（ICHQ5A修订、PDATR41和47、ASTME-12和WK）的制定。然而，最近出现了批量制造过程向连续制造（CM）范式推进的趋势。
CM是治疗性蛋白质制造发展的下一步，有望通过立即捕获和纯化在生物反应器中生产的目标蛋白质来提高效率（图1）。这种生产和纯化的整合可以缩短处理时间，减少人工干预，并通过使用较小的罐、生物反应器和柱子来减小设施规模。尽管有这些优势，但单个单元操作及其连接接口与批处理模式处理的不同，这在如何确保病毒安全和其它基于风险的方法方面产生了独特的挑战。CDER研究人员与外部利益相关者合作，调查这些独特的挑战及其对病毒安全的影响。
图1.批制造与连续制造的比较。批制造可能使用大型生物反应器（12kL），其内容物作为一个池收集。因此，纯化需要在每个单元操作之间使用带有洗脱汇集步骤的大直径柱，以在下一步之前均质化和缓冲调节产物流体流。由于保留步骤，原液生产可能需要数周时间。连续制造由集成的单元操作组成，并具有贯穿整个过程的连续物料流。生物反应器以设定的速率灌注，其流出物直接进入纯化序列，导致在类似或延长的时间范围内定期或连续收集原原液，以满足产品需求。
为连续制造开发小规模病毒清除模型
CDER研究人员发现三个工艺步骤是在CM操作中促进病毒清除的关键：捕获色谱、病毒灭活和病毒过滤。对于这些步骤，CM涉及对设备的新技术变更（多柱色谱法）或从固有的静态步骤调整为具有延长处理时间的动态步骤（连续病毒灭活和过滤）。尽管ICHQ5A指南提供了有关病毒安全性的指南，但其在制定时考虑的是批处理。因此，需要根据ICHQ5A原则对这些集成的连续工艺步骤进行小规模研究。为了提供科学理解，CDER实验室研究了一种市售的连续色谱系统，并开发了一种用于连续病毒过滤的潜在代表性小规模模型。
连续捕获色谱模型
连续捕获色谱使用多个较小的捕获柱，它们可以以循环模式同时过载、洗涤或洗脱。色谱柱过载并随后在第二个色谱柱上进行捕获，可使树脂使用效率超过95%（相比之下，批操作的效率约为65%），并总体上减少了处理时间和树脂成本；然而，过载和额外的色谱柱，以及额外的流路和阀门，可能会影响原液的病毒安全性。CDER研究人员与设备制造商合作，对连续捕获色谱步骤和批量捕获色谱步骤进行了并排病毒清除比较（Chiangetal.,）。研究发现，虽然初始周期或“启动周期”可能会影响log10减少值(LRV)的变异性，但稳态病毒清除能力相似，在一个周期内的色谱柱之间看不到差异（图2）。此外，无论运行条件如何，在连续捕获操作和传统批处理模式操作之间都观察到了类似的LRV。这些结果表明，使用多柱色谱法对病毒安全性的影响可能很小，并且在适当的监管指导下，模拟批量的小规模设计是可行的。
图2.收获的含有单克隆抗体A的细胞培养液中加入噬菌体PR或PhiX，然后通过连续蛋白A或分批蛋白A工艺步骤纯化抗体。条形图显示在最佳情况和最坏情况下以连续模式运行时的PR清除(A)或PhiX清除(B)。“1+1”表示来自一个柱子的流出物随后被单个柱子捕获并且不分流至两个柱子。C)从批处理模式或连续模式中获得的两种病毒的总体log10减少值(LRV)值在最佳和最坏情况下运行。参见（Chiangetal.,）。
病毒过滤
在连续病毒过滤的情况下，病毒过滤器在操作中可能会发生三个潜在的变化：1)处理时间和/或体积延长，2)来自先前纯化步骤的动态或波动的产品流体流，以及3)连续流量而不是连续压力。虽然有一些基于连续流操作病毒过滤器的实例，但没有开发模型可以评估在低压下进行多天病毒过滤的能力，或者模拟加载到过滤器上的动态产品流体流。CDER研究人员与过滤器制造商合作，使用特征明确的细小病毒替代物、噬菌体PP7和选定的人类免疫球蛋白作为要纯化的蛋白质，成功开发了缩小模型来满足这一需求（Luteetal.,）。他们的扩展过程模型能够在不超过推荐的过滤器跨膜压力的情况下运行病毒过滤器超过4天，并且在过滤时间过程中不会损失病毒峰值传染性（图3A）。在每日汇集的流出物中未检测到病毒（6LRV），表明病毒清除有效。第二个模型能够成功地对过滤器施加动态负载，导致蛋白质浓度、缓冲液电导率和病毒浓度的梯度增加。结果表明，虽然动态流体流对过滤压力有影响（图3B），但对病毒清除的影响很小，观察到的病毒通过增加与加载的总病毒颗粒和使用的过滤器有关。尽管这些研究是蛋白质、缓冲液和过滤器特定的，但这些模型可以应用于其它系统，作为了解连续处理对病毒过滤影响的起点。
图3.连续病毒过滤模型的代表性示例。A)扩展处理模型，显示病毒和蛋白质负载超过4天，吞吐量为L/m2。蓝色和绿色曲线是2次独立运行的跨膜压(TMP)。在这4天里，没有在任何样本中检测到病毒。B)波动负载模型显示蛋白质峰和病毒被应用于病毒过滤器。橙色曲线是UV曲线,表明流出物中的蛋白质浓度与所应用的蛋白质加标相匹配。蓝色轨迹显示TMP受到高蛋白质峰值的影响，压力可能不会回到基线。注意：来自波动负载模型的LRV数据：使用Planova20N过滤器运行2次（跟踪图见B）和使用PlanovaBioEX过滤器运行2次，表明病毒载量的增加仅导致病毒通过20N过滤器。样品名称与B中的虚线一致,加标样品是加标期间的2mL级分。
这项工作如何推进药品和生物制品的评估以及政策？
连续制造对于治疗性蛋白质来说仍然是一个新概念，并且很少有已发表的研究致力于确保此类治疗剂不会因病毒而受到污染。诸如此类的研究为内部和外部利益相关者提供了深入了解潜在病毒安全问题和用于制造开发研究的潜在方法的见解。随着具有连续制造要素的监管申请的申报增加,FDA主题专业知识和有形的公开可用示例对于成功实施连续制造范式至关重要，并可支持新兴技术计划和其它评估。
引用
Chiang,M-J,Pagkaliwangan,M,Lute,S,Bolton,G,Brorson,K,Schofield,M.Validationandoptimizationofviralclearanceinadownstreamcontinuouschromatographysetting.BiotechnologyandBioengineering.;:–.
Lute,S,Kozaili,J,Johnson,S,Kobayashi,K,Strauss,D.Developmentofsmall-scalemodelstounderstandtheimpactofcontinuousdownstreambioprocessingonintegratedvirusfiltration.BiotechnolProgress.;36:e.
编译：识林-蓝杉
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本文编辑：佚名
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